XV Carnaval de Física, "Dorando Células Cancerosas"

XV Carnaval de Física, Dorando Células Cancerosas

En esta ocasión se celebra el XV Carnaval de la física que en esta ocasión alberga Manuel Sanchez en su blog “Curiosidades de la microbiología” El límite para enviar entradas es el 25 de enero; él recopilará las entradas el 30 de enero en su blog. ¡Anímate y participa! Como el blog anfitrión quiere que “si es posible, que las entradas traten un tema que tenga alguna relación con el mundo de la Física y sus relaciones con los mundos de la Biología y/o de la Química,” mi aportación es INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS DE ORO MARCADAS CON PROTOPORFIRINA IX EN CÉLULAS CANCEROSAS.

Admito que el titulo “Dorando Células Cancerosas” es un tanto exagerado, pero me pareció simpático, la incorporación de nanopartículas de oro en células cancerosas fue objeto de un estudio serio que realizaron E. Maldonado, E. Ramón del Laboratorio de Citopatología ambiental de la ciudad de México, junto a M. E. Sánchez de la Central de Instrumentación de Microscopía también de la ciudad de México, también les acompañó en este estudio I. J. Galván de la Unidad de Microscopía focal de la misma ciudad; estudio que presentaron en el X Congreso Nacional de Microscopía que se realizó en la ciudad de Morelia en México el recién pasado 2010.

La nanotecnología está emergiendo como un nuevo campo interdisciplinario de investigación que promete alcanzar grandes avances con respecto al cáncer principalmente en la detección, diagnóstico y tratamiento [Priya Pathak and V. K. Katiyar, AZojono, 3 (2007) 1 – 17]. La ventaja que ofrece el utilizar nanomateriales es que partículas metálicas, semiconductores y partículas biodegradables poseen novedosas propiedades ópticas, electrónicas, magnéticas y estructurales que no se encuentran en moléculas individuales. El desarrollo de nanopartículas covalentemente unidas a moléculas biológicas como péptidos, proteínas, ácidos nucleicos u otras moléculas pequeñas emerge como un campo prometedor en la investigación aplicada al cáncer. En particular las nanopartículas de oro (npAu) poseen propiedades químicas y físicas únicas que permiten una fácil conjugación con moléculas biológicas, lo cual les da actividad terapéutica, de vector y marcador fluorescente. Estas propiedades hacen de ellas una herramienta potencialmente útil en la terapia fotodinámica (PDT). La PDT involucra la presencia simultánea de un fotosensibilizador, luz de una longitud de onda apropiada y la presencia de oxigeno para la eliminación del tejido tumoral [Prasad P.N. Introduction to Biophotonics Wyley & Sons. New Jersey. 2003.]. El objetivo del trabajo de E. Maldonado et. al.  fue sintetizar y caracterizar npAu marcadas con protoporfirina IX (PpIX), así como analizar su incorporación en células HeLa, actualmente se determina el potencial de éstas en la terapia fotodinámica. En dicho trabajo se empleó una línea celular de cáncer cervicouterino, debido a que es la segunda causa de muerte por cáncer en las mujeres mexicanas [Instituto Nacional de Estadística y Geografía (2009). “Estadísticas a propósito del día mundial contra el cáncer.”].

Ellos sintetizaron nanopartículas de oro mediante el método de coloides monodispersos a partir de AuHCl4, como agente reductor emplearon ácido ascórbico [J. Wagner and J. M. Köhler, Nano Lett., 5 (2005) 4.], a éstas npAu se les unieron moléculas de cisteína mediante calentamiento a 60°C durante 48 horas. La cisteína funciona como enlace entre la nanopartícula y la molécula de PpIX. La unión de la PpIX la realizaron mediante la síntesis estándar de Hermans [Hermans, G.T., Bioconjugate techniques. Academic Press. 1996.]. El conjugado npAu–PpIX lo purificaron mediante diálisis y se caracterizó por espectroscopia UV-VIS e infrarrojo y microscopía electrónica de transmisión (TEM).

Una vez obtenido y caracterizado el conjugado procedieron a determinar la concentración segura en células HeLa mediante ensayos de viabilidad por la técnica de Azul Alamar. Se realizó una cinética de incorporación del conjugado exponiendo las células a las npAu-PpIX durante 5 minutos, 2, 4, 8 y 12 horas, la cinética se realizó por duplicado, una serie se observó mediante TEM y otra serie mediante microscopía confocal, ambas técnicas se realizaron para

determinar el tiempo de incorporación del conjugado en las células, las imágenes obtenidas por microscopía confocal fueron analizadas en el plano ecuatorial con el programa Image J para cuantificar la intensidad de fluorescencia.

Los Resultados

Se obtuvieron npAu empleando el método de coloides monodispersos. Se obtuvieron npAu de un diámetro promedio de 29.2 nm como muestra la siguiente figura 1a

 (figura 1a),

posteriormente hicieron la conjugación con L-cisteína, esta molécula proporcionó el grupo amino que reaccionó con el grupo carboxilo presente en la PpIX para así formar el conjugado

npAu-PpIX. Al caracterizar las npAu-PpIX mediante espectroscopía UV-VIS (figura 1b),

Figura 1b abajo

se observó la banda de Soret característica de las porfirinas, a través del análisis por IR (figura 1c) 

se observó el corrimiento del pico a 1558 cm-1 correspondiente al carbonilo del carboxilo presente en la PpIX, hacia los 1703 cm-1, lo cual indica la transformación del grupo carboxilo a amida secundaria. Al complementar los resultados anteriores con la micrografía obtenida por TEM (figura 1d) se demostró que el núcleo del conjugado está constituído por npAu.

Determinaron que la concentración segura para usarse en la cinética de incorporación del conjugado es de 20 mg/mL. Se pudo observar mediante microscopía confocal que desde los 5 minutos de exposición de las células al conjugado hubo una acumulación intracelular considerable de éste. 

En la figura 2 arriba se muestra la serie completa de la cinética y los valores de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias, se puede apreciar como la fluorescencia se incrementa conforme el tiempo de exposición del conjugado a las células es más largo, hasta llegar a las 12 horas, tiempo en el cual se observa un decremento. 

En la figura 3 arriba se muestran dos micrografías obtenidas por TEM, en la figura 3a se muestra una célula sin tratamiento, en la figura 3b se puede apreciar una acumulación del conjugado en la periferia del núcleo celular, mientras que en la figura 3c se observa la presencia de npAu-PpIX en el núcleo.

LAS CONCLUSIONES

Sintetizaron y caracterizaron el conjugado de npAu-PpIX. La PpIX cuando se une a las np-Au conserva sus propiedades biofísicas y químicas de fotosensibilizador por lo que se puede esperar una buena respuesta cuando se use el conjugado en la PDT. Mediante microscopía electrónica de transmisión y microscopía confocal demostraron que las nanopartículas se incorporan en las células y se acumulan en su mayoría en el citoplasma y en menor proporción en las mitocondrias y núcleo. El tiempo en el que alcanzan la máxima acumulación intracelular las npAu-PpIX fue a las 8 horas.

Salu2 a tod@s y Felíz cumpleaños a Raquel allá en España pues hoy esta de cumpleaños

Mr. Moon.

La vida es un 10% como viene y un 90% como la tomamos